日本三区精品视频在线观看-少妇放荡的呻吟干柴烈火韩剧-日本少妇熟女一区二区-久久香蕉久久香蕉久久

紫外分光光度法測定DNA蛋白質(zhì)含量

美析儀器有限公司

一、實驗?zāi)康?nbsp;

? 學習紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理；

? 掌握紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實驗技術(shù)；

? 掌握UV-1700紫外可見分光光度計的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。 

二、實驗原理 

    紫外可見吸收光譜法又稱紫外可見分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對光的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外可見吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價電子躍遷的結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜.

定性分析:利用紫外可見吸收光譜法進行定性分析一般采用光譜比較法。即將未知純化合物的吸收光譜特征，如吸收峰的數(shù)目、位置、相對強度以及吸收峰的形狀與已知純化合物的吸收光譜進行比較。      

    定量分析: 紫外可見吸收光譜法進行定量分析的依據(jù)是朗伯-比爾定律：A=lgI0/I=εbc，當入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比，即物質(zhì)在一定波長處的吸光度與它的濃度成線形關(guān)系。因此，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度，就可求出溶液中物質(zhì)濃度和含量。由于zui大吸收波長λmax處的摩爾吸收系數(shù)zui大，通常都是測量λmax的吸光度，以獲得zui大靈敏度。 

光度分析時，分別將空白溶液和待測溶液裝入厚度為b的兩個吸收池中，讓一束一定波長的平行單色光非別照射空白和待測溶液，以通過空白溶液的透光強度為I0，通過待測溶液的透光強度為I，根據(jù)上式，由儀器直接給出I0與I之比的對數(shù)值即吸光度。 

   紫外可見分光光度計:紫外可見吸收光譜法所采用的儀器稱為分光光度計，它的主要部件有五個部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測器、信號顯示器；

由光源發(fā)出的復合光經(jīng)過單色器分光后即可獲得任一所需波長的平行單色光,該單色光通過樣品池靜樣品溶液吸收后，通過光照到光電管或光電倍增管等檢測器上產(chǎn)生光電流，產(chǎn)生的光電流由信號顯示器直接讀出吸光度A。可見光區(qū)采用鎢燈光源、玻璃吸收池;紫外光區(qū)采用氘燈光源、石英吸收池。 

本實驗采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中*和*殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其zui大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差別）。在zui大吸收波長處，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系服從朗伯-比耳定律。該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優(yōu)點。 

三、儀器與試劑 

UV-1700美析儀器-紫外可見分光光度計，比色管，吸量管 標準蛋白質(zhì)溶液：5.00 mg.mL-1溶液 0.9% NaCl溶液，待測蛋白質(zhì)溶液 

四、實驗步驟 

<一>準備工作 

1. 啟動計算機，打開主機電源開關(guān)，啟動工作站并初始化儀器。    
2.  在工作界面上選擇測量項目（光譜掃描，光度測量），本實驗選擇光度測量，設(shè)置測量條件（測量波長等）。 

3. 將空白放入測量池中，點擊START掃描空白，點擊ZERO校零。 

4. 標準曲線的制作。  

 <二>測量工作  

 1.吸收曲線的繪制: 

    用吸量管吸取2mL5.00mg/mL標準蛋白質(zhì)溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl

溶液稀釋至刻 度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液為參比，在190 nm～400nm區(qū)間，測量吸光度。   

 2. 標準曲線的制作 ： 

    用吸量管分別吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5  mL 5.00 mg.mL-1標準蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測定各標準溶液的吸光度A278

記錄所得讀數(shù)。 

 3. 樣品測定： 

     取適量濃度的待測蛋白質(zhì)溶液3 mL，按上述方法測定278 nm處的吸光度。平   行測定三份。 

五、數(shù)據(jù)處理： 

1. 以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制吸收曲線，找出zui大吸收波長。               

         由吸收曲線可得zui大吸收波長λmax=278nm(圖略)  

2. 以標準蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。   

標準溶液濃度C(mg/mL) 

吸光度A 0.25 0.171 0.50 0.335 0.75 0.482 1.00 0.637 1.25 

標準溶液濃度C(mg/mL)

y=0.6208x+0.0186R2

=0.9998

濃度C-吸光度A標準曲線方程是：A=0.6208*C+0.0186         

 3. 根據(jù)樣品蛋白質(zhì)溶液的吸光度，從標準曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度。 

平行測定次數(shù) 樣品液吸光度A 樣品溶液濃度C(mg/mL) 

1 0.676 1.059 2 0.672 1.053 3 0.674 1.056 

所測溶液平均濃度:    C=(C1+C2+C3)/3=1.056 mg/mL 

測量的標準偏差：     S=√Σ(Xi－X)2/(n－1)=0.003 

待測蛋白質(zhì)溶液濃度為：1.056 mg/mL*10mL/3mL=3.520 mg/mL。