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新鮮冰凍**章解凍的FFP誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌機(jī)制及功能研究 失血性休克(Hemorrhagic shock, HS)是軍民和居民戰(zhàn)(創(chuàng))傷死亡的主要原因。在臨床治療過程中,與傳統(tǒng)復(fù)蘇液乳酸林格氏液(lactated ringer, LR)相比,新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma, FFP)因其在復(fù)蘇病員中提高患者生存率,具有一定的優(yōu)勢(shì),被臨床創(chuàng)傷救治廣泛采用。而一氧化氮(nitric oxide, NO)是介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能重要分子,我們?cè)O(shè)想FFP復(fù)蘇失血性休克的療效可能得益于誘導(dǎo)NO分泌和舒張血管。為了探討FFP復(fù)蘇作用分子機(jī)制,本文采用NO/Nitrite/Nitrate分析法首先檢測(cè)了HS大鼠模型FFP及LR復(fù)蘇后不同時(shí)間點(diǎn)血清中NO含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FFP復(fù)蘇后HS大鼠血清中NO含量顯著增加(p0.05)。與單獨(dú)HS組大鼠相比,FFP復(fù)蘇組HS大鼠血清中NO含量增加幅度大,出現(xiàn)時(shí)間早(p0.05),而LR復(fù)蘇卻降低大鼠HS復(fù)蘇后各時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)NO含量。同樣對(duì)體外培養(yǎng)人肺正常微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMECs)和人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(HDLECs)FFP處理后NO含量進(jìn)行分析,結(jié)果FFP處理后血管內(nèi)皮細(xì)胞NO生成同樣增加,與對(duì)照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(p0.05)。為了探討FFP復(fù)蘇對(duì)HS大鼠血管舒張功能的影響,隨后測(cè)定各組大鼠乙酰*誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng),與單獨(dú)HS組相比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FFP復(fù)蘇顯著增加乙酰*誘發(fā)內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)(分別是49±4mmHg與37±4 mmHg)(p0.05)。進(jìn)一步探討FFP誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌分子機(jī)制,采用磷酸化蛋白激酶抗體芯片和免疫印跡方法篩選和鑒定FFP處理后內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)蛋白激酶磷酸化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)為FFP顯著增加兩株內(nèi)皮細(xì)胞12種蛋白激酶磷酸化,且在兩株內(nèi)皮細(xì)胞中FFP均能誘導(dǎo)AMPKα1,Akt1和eNOS磷酸化。FFP誘導(dǎo)eNOS磷酸化在FFP復(fù)蘇HS大鼠的肺組織中同樣得到了證實(shí)。表明FFP體內(nèi)外均能激活A(yù)MPKα1／Akt1／eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。分別采用Compound C(AMPK的抑制劑),LY294002(PI3K／Akt抑制劑)或L-NAME(NOS抑制劑)預(yù)處理HPMECs細(xì)胞,阻擋AMPKα1／Akt1／eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,結(jié)果為上述三種抑制劑均能抑制FFP誘導(dǎo)eNOS激活和NO生成,提示AMPKα1／Akt1／eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活介導(dǎo)FFP誘導(dǎo)NO分泌和血管舒張。 本項(xiàng)目報(bào)道FFP誘導(dǎo)增加HS大鼠血清和體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞上清NO含量,并進(jìn)一步篩選和鑒定出AMPKα1／Akt1／eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)FFP誘導(dǎo)NO分泌和血管舒張,揭示了FFP復(fù)蘇保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞新機(jī)制。為了進(jìn)一步探討FFP誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增加NO抑制HS誘導(dǎo)血管收縮改善微循環(huán)及修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能提供科學(xué)依據(jù)。 第二章解凍的FFP對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響及機(jī)制研究 失血性休克是創(chuàng)傷后死亡的首要原因。zui近的臨床研究表明,盡早、盡快地采用新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma, FFP)進(jìn)行復(fù)蘇能顯著改善臨床失血性休克復(fù)蘇效果。為了滿足各地救治中心對(duì)FFP日益增長(zhǎng)的需求及快速便捷獲得FFP,經(jīng)批準(zhǔn)新鮮解凍血漿4℃貯存不多于5天仍可用臨床復(fù)蘇。研究報(bào)道FFP中含有高濃度與內(nèi)皮細(xì)胞遷移有關(guān)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transform growth factor-β, TGF-β)。由此我們?cè)O(shè)想FFP可能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移,貯存的FFP可能改變了生長(zhǎng)因子水平和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而降低FFP療效。本項(xiàng)目以遷移力作為功能研究著眼點(diǎn),比較新鮮解凍血漿(FFP Day 0)和4℃貯存5天FFP(FFP Day 5)在正常氧供和缺氧條件下誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TGF-p信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響以及FFP貯存過程中TGF-p濃度變化。FFP(Day 0)和FFP(Day 5)分別處理人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human pulmonary microvascular endothelial cells, HPMECs)和人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(human dermal lymphatic endothelial cells, HDLECs)后,行遷移實(shí)驗(yàn)和Western印跡分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1)在正常供氧和缺氧條件下,FFP(Day 0)和FFP(Day 5)均能促進(jìn)細(xì)胞遷移,而FFP(Day 5)促進(jìn)細(xì)胞遷移能力顯著下降(p0.05)；2)FFP(Day 0)與FFP(Day 5)相比,TGF-β1水平顯著升高(p0.05)；3)抑制TGF-βI型受體ALK5的活性后,增強(qiáng)FFP(Day 0)和FFP(Day 5)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力；4)FFP處理后顯著增加TGF-p信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子Smad2／3磷酸化,預(yù)處理ALK5活性可抑制其磷酸化。在體外培養(yǎng)兩株內(nèi)皮細(xì)胞中,FFP(Day 5)誘導(dǎo)增加Smad2／3磷酸化幅度大,與FFP(Day 0)相比,具有顯著性差異(p0.05)。結(jié)果表明TGF-β1／ALK5／Smad2／3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與抑制FFP誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移,標(biāo)準(zhǔn)貯存導(dǎo)致TGF-β1水平升高和增加TGF-β1／ALK5／Smad2／3信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而削弱FFP促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。 本項(xiàng)目報(bào)道FFP不管是在正常供氧還是在缺氧條件下均能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移,貯存將增加細(xì)胞因子TGF-β1水平及增強(qiáng)TGF-β1/ALK5/Smad2/3信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),并降低FFP誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移,為進(jìn)一步探討FFP通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移參與失血性休克后血管內(nèi)皮完整和功能的恢復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。